P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP Binding Cassette，ABC）蛋白家族，是一種ATP依賴性的跨膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在人體中主要由多藥耐藥基因（multi-drug resistance 1，MDR1）又稱為ABCB1基因編碼。P-gp與多藥耐藥和藥物相互作用（drug-drug interactions，DDI）都有關(guān)，美國(guó)、歐洲和中國(guó)的藥品監(jiān)管部門相繼出臺(tái)指導(dǎo)原則，將轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的DDI研究列為評(píng)價(jià)新藥安全性和有效性的重要指標(biāo)，也明確指出應(yīng)通過(guò)體外研究評(píng)估在研藥物是否為P-gp的底物、抑制劑和誘導(dǎo)劑，為體內(nèi)研究提供參考。基于以上需求，IPHASE/匯智和源繼成功構(gòu)建SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞，包括OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1和MATE2-K后，又成功構(gòu)建國(guó)內(nèi)-首·家P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體膜囊泡，助力新藥研發(fā)。

P-gp簡(jiǎn)介

P-gp是藥物發(fā)現(xiàn)中最為熟知的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，可從多種細(xì)胞中排出化合物，最早于1976年由研究人員首先在秋水仙堿耐藥的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞株的質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn)，是第一個(gè)被克隆的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

在人體中，P-gp最初被認(rèn)為是導(dǎo)致急性髓系白血病多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，后來(lái)逐步發(fā)現(xiàn)它存在于多種組織細(xì)胞中，如全身各種上皮細(xì)胞、肝 細(xì)胞、腎細(xì)胞，在血液細(xì)胞和免疫細(xì)胞上也有表達(dá)。P-gp主要主動(dòng)運(yùn)輸各種疏水化合物，包括小分子化合物、生物堿、以及各種天然或人工合成的有毒物質(zhì)。

P-gp 由1280個(gè)氨基酸殘基組成，由于糖基化程度的差異，分子量在130~190 kDa之間。P-gp分子包括N端和C端兩個(gè)同源片段，每個(gè)片段各有6個(gè)疏水性跨膜區(qū)(transmembrane domain, TMD)和1個(gè)親水性的ATP結(jié)合區(qū)(nucleotide binding domain, NBD)。這些跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)與中性或帶正電的親脂性藥物結(jié)合，激活了P-gp的 ATP 酶活性，2個(gè)ATP水解釋放的能量供轉(zhuǎn)運(yùn) 1個(gè)藥物分子，將藥物直接從脂質(zhì)雙分子層轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，降低藥物的細(xì)胞內(nèi)濃度，從而導(dǎo)致多藥耐藥。

圖1  P-糖蛋白結(jié)構(gòu)

P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)的研究模型

目前，體外評(píng)估由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的DDI模型主要包括膜囊泡系統(tǒng)、基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以及“三明治"培養(yǎng)肝細(xì)胞。

2.1 膜囊泡系統(tǒng)

膜囊泡系統(tǒng)是研究在研藥物是否為P-gp的底物和抑制劑的最-常用的模式。膜囊泡可通過(guò)感染昆蟲細(xì)胞（如Sf9或Sf21），或轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如HEK293、HeLa、V79或MDCK）等進(jìn)行制備。囊泡外翻后，原本表達(dá)在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)體將被外翻至囊泡外，與藥物共孵育時(shí)，藥物直接作用于外翻轉(zhuǎn)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到囊泡內(nèi)，可檢測(cè)藥物的吸收而非外排，即測(cè)定囊泡內(nèi)藥物含量即可反應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)藥物的作用。該模型不但具有操作簡(jiǎn)便，無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，更主要的是如果化合物分子量大，不易透過(guò)細(xì)胞膜時(shí)，細(xì)胞模型將無(wú)法研究藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，而外翻膜囊泡模型則不受化合物滲透性的影響。

 圖2 膜囊泡系統(tǒng)的作用機(jī)理

2.2 基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是指能夠自發(fā)極化形成完整細(xì)胞單層的細(xì)胞系，如Caco-2、MDCK、LLC-PK1等。將細(xì)胞接種在Transwell小室上，培養(yǎng)至形成完整的極化細(xì)胞單層，將受試藥物添加到單層細(xì)胞的頂端（apical，AP）或基底側(cè)（basolateral，BL），測(cè)量滲透入接收室中的藥量，根據(jù)AP→BL（吸收）和BL→AP（流出）兩個(gè)方向上的表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficient，Papp）計(jì)算外排率（efflux ratio，ER），評(píng)價(jià)化合物是否為該ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體底物。此外，通過(guò)測(cè)量探針底物在BL→AP方向的凈流量或ER值的變化，也可以進(jìn)行化合物對(duì)特定轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制作用的評(píng)估。

2.3 三明治培養(yǎng)肝細(xì)胞

肝細(xì)胞中除了含有豐富的藥物代謝酶，還表達(dá)多種重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體。三明治培養(yǎng)是將肝細(xì)胞培養(yǎng)于兩層膠原之間，底層為鼠尾膠使肝細(xì)胞貼壁，上層為Matrigen膠使其形成肝板樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)幾天后，肝細(xì)胞形成完整膽小管網(wǎng)絡(luò)并同時(shí)保持緊密連接，且肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)體正常表達(dá)并定位于恰當(dāng)?shù)哪^(qū)域，可用于轉(zhuǎn)運(yùn)體功能研究。

IPHASE轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)品

作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，IPHASE以HEK293為載體，成功構(gòu)建轉(zhuǎn)染重組P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體，并通過(guò)特殊的手段制備成外翻膜囊泡，助力藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的DDI研究。

IPHASE技術(shù)人員以終濃度為1μM的他林洛爾（Talinolol）為底物，分別于ATP和AMP兩個(gè)不同的條件下與P-gp囊泡進(jìn)行孵育，通過(guò)LC-MS/MS檢測(cè)他林洛爾的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，結(jié)果顯示P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體膜囊泡ATP組的轉(zhuǎn)運(yùn)活性為AMP組的5.8倍，高于《藥物相互作用指導(dǎo)原則2020》規(guī)定的2倍，表明P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體膜囊泡構(gòu)建成功！

圖3 他林洛爾轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果分析

除ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體囊泡P-gp外，IPHASE已成功推出全面匹配指導(dǎo)原則需求的SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞及配套產(chǎn)品，供客戶自行選擇。同時(shí)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體囊泡BCRP也正在優(yōu)化中，敬請(qǐng)期待……

參考文獻(xiàn)：

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[4]《藥物相互作用指導(dǎo)原則2020》

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