冷凍保護(hù)劑添加了冷凍保護(hù)劑的凍存液，一般都是高滲透壓的。當(dāng)細(xì)胞從生理溶液轉(zhuǎn)移到低溫保存溶液時(shí)，由于胞外溶液中的滲透壓較高，細(xì)胞會(huì)脫水，同時(shí)低溫保存溶液的小分子擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，細(xì)胞體積會(huì)緩慢減少；如果冷凍保存液中只有非穿透性冷凍保護(hù)劑(如葡聚糖和蔗糖)，細(xì)胞也會(huì)脫水并保持脫水狀態(tài)，只是冷凍保護(hù)劑不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在解凍復(fù)蘇階段，水從細(xì)胞外的低滲溶液迅速移動(dòng)到細(xì)胞內(nèi)的高滲透溶液，而小分子冷凍保護(hù)劑則向相反的方向緩慢移動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞體積膨脹，并達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓恢復(fù)平衡。所以，在細(xì)胞冷凍處理和解凍復(fù)蘇的過程中，稍有差錯(cuò)，細(xì)胞就會(huì)因?yàn)闈B透壓的過度變化，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂而死亡。這就是細(xì)胞的滲透壓力性損傷。

　　細(xì)胞凍存和復(fù)蘇采取“慢凍快融”的原則，慢速冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水份滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)形成冰晶的機(jī)會(huì)，快融以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化水份滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)冰晶造成對(duì)細(xì)胞的損傷。

　　(一)細(xì)胞凍存

　　配制含10%DMSO或甘油的細(xì)胞凍存液，4℃預(yù)冷(新鮮配制的凍存液會(huì)產(chǎn)生大量的熱)；

　　取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用細(xì)胞消化酶將單層生長的細(xì)胞消化下來；懸浮細(xì)胞則直接將細(xì)胞收集到離心管中；

　　離心1200rpm，6 min；

　　去除上清液，逐漸加入適量預(yù)冷的細(xì)胞凍存液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中的細(xì)胞終濃度為5×10e6/ml~1×10e7/ml；

　　將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1~1.5ml；

　　在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱、凍存時(shí)間及操作人員姓名；

　　凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/min；到達(dá)-80℃時(shí)，則可迅速放入液氮中。

　　(二)細(xì)胞復(fù)蘇

　　佩戴眼鏡和手套，從液氮中取出凍存的細(xì)胞管。

　　迅速放入38℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，在1分鐘內(nèi)使其*融化，然后在無菌條件下取出細(xì)胞。

　　1200rpm/min離心5-10min，棄去上清，加入適量培養(yǎng)液混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，次日更換一次培養(yǎng)液。

　　解凍后洗滌是去除冷凍保護(hù)劑最常見的方法，即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌液或培養(yǎng)液重懸后離心，去除上清液，然后將細(xì)胞重新懸浮在洗滌液或培養(yǎng)液中。然而，需要注意的是，解凍后洗滌會(huì)造成凍存細(xì)胞的數(shù)量損失。